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近年來，下一代測序技術(shù)（NGS）越來越受到診斷實(shí)驗(yàn)室的歡迎，然而，基于NGS的診斷還面臨著很多障礙。近日，Nature子刊《European Journal of Human Genetics》雜志以BRCA為例，從診斷實(shí)驗(yàn)室角度闡述了基因檢測面臨的新挑戰(zhàn)。
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大規(guī)模并行測序技術(shù)和NGS平臺的快速發(fā)展，使遺傳性疾病的管理發(fā)生了顛覆性變化。多數(shù)基因檢測早期臨床研究表明，與現(xiàn)有方法相比，NGS可提供一種高靈敏度、高特異性以及高成本效益的診斷手段，目前，NGS在臨床上越來越吸引診斷實(shí)驗(yàn)室。
隨著基因檢測的需求增加，診斷實(shí)驗(yàn)室面臨的壓力越來越大，他們需要不斷提高基因突變的篩查能力，且明確變體的臨床意義仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，同時基因檢測流程的復(fù)雜性增加了NGS診斷的難度，其中包括NGS平臺、富集方法以及生物信息分析的復(fù)雜性等。
高效、高性價比的突變檢測方法以及標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)性的NGS檢測報(bào)告是診斷的基本要求。近日，Nature子刊《European Journal of Human Genetics》雜志從診斷實(shí)驗(yàn)室角度闡述了BRCA基因檢測面臨的新挑戰(zhàn)。
挑戰(zhàn)一：測序平臺的選擇
隨著技術(shù)的發(fā)展，NGS平臺能在較短的運(yùn)行時間（<24H）內(nèi)實(shí)現(xiàn)gigabase大規(guī)模的DNA測序，例如Illumina的Miseq和Life Technologies的PGM。
MiSeq通過將基因組DNA的隨機(jī)片斷附著到光學(xué)透明的表面，這些DNA片斷通過延長和橋梁擴(kuò)增，形成了具有數(shù)以億計(jì)cluster的Flowcell，每個cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測序。
Life Technologies公司的Ion Personal Genome Machine (PGM™) 測序儀
Ion Torrent PGM使用了一種高密度半導(dǎo)體小孔芯片。該芯片置于一個離子敏感層和離子感受器之上，每當(dāng)有核苷酸分子被摻入時就會釋放出質(zhì)子，而離子感受器就會感受到這種信號，知道是哪一個核苷酸被摻入，從而讀出DNA序列。
測序平臺的快速發(fā)展使得一些出版物的陳述有些過時，鑒于此，診斷實(shí)驗(yàn)室在選擇NGS平臺時，應(yīng)該關(guān)注平臺的更新，其中包括分子生態(tài)學(xué)家等對指南的更新。
然而，平臺的選擇只是NGS工作流程中需要考慮的因素之一，該因素與其他因素相互依賴，包括富集方法和數(shù)據(jù)分析等。
挑戰(zhàn)二：富集方法
與全基因組相比，NGS在臨床上通常被用于檢測特異性基因，如BRCA1和BRCA2基因。因?yàn)镹GS捕獲和檢測特異性基因的成本及時間效益會更高，這也推動了多種富集方法的發(fā)展，目前最常用的富集方法依賴于PCR或雜交技術(shù)。然而，每種技術(shù)都有一定的優(yōu)劣勢。
PCR是一種行之有效的測序前富集技術(shù)，尤其是用于Sanger測序平臺。對于NGS平臺，實(shí)驗(yàn)室已成功開發(fā)出用于BRCA基因檢測的長片斷PCR技術(shù)。然而，為了充分利用NGS的高通量特性，實(shí)驗(yàn)人員往往會準(zhǔn)備大量的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，這就導(dǎo)致了對于一個特定基因或基因Panel，市場上會發(fā)展起多個多重PCR試劑盒，例如，用于BRCA檢測的多重PCR試劑盒就有Multiplicom公司的CE-IVD BRCA MASTR、賽默飛的Ion Ampliseq Community Panel 以及德國Qiagen的 GeneRead DNASeq等。雖然PCR作為高靈敏度和高特異性的富集技術(shù)，但應(yīng)用在大規(guī)?；蚪M靶標(biāo)檢測時卻十分低效。
雜交富集方法具有高度可擴(kuò)展性等優(yōu)點(diǎn)，目前市場上也有多種基于該技術(shù)的BRCA檢測試劑盒，例如Agilent公司的HaloPlex和SureSelect，此外市場上還有包含BRCA基因在內(nèi)的多種癌癥基因panel檢測試劑盒，例如Illumina開發(fā)了針對94個基因的試劑盒，羅氏開發(fā)了針對578個基因的試劑盒。然而，值得指出的是，當(dāng)基因panel較寬泛時，雜交技術(shù)尤其是微陣列捕獲技術(shù)可能會增加額外的成本以及時間。
挑戰(zhàn)三：生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)
NGS檢測產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)需進(jìn)行生物信息學(xué)分析、變體識別（variant call）以及數(shù)據(jù)篩查后才能使用。對于NGS數(shù)據(jù)分析，診斷實(shí)驗(yàn)室有多種選擇，然而，要獲取具有臨床價值的可靠數(shù)據(jù)，選擇合適的分析軟件和全面驗(yàn)證至關(guān)重要。
目前市場上的商用分析軟件有 NextGENe、CLC Workbench 以及一些與具體測序平臺相連的軟件，例如Life Technologies的Torrent Suite Software Plugins等。一些開放的生物信息學(xué)軟件可用來創(chuàng)建自定義生物信息學(xué)分析途徑，例如， Pindel、VarScan、GATK-lite 和Samtools。然而，值得注意的是，從醫(yī)學(xué)分析水平來看，從生物信息學(xué)到NGS診斷還面臨很大的挑戰(zhàn)。
追蹤和管理NGS臨床樣本需要一個實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS），該系統(tǒng)既支持NGS、適合診斷實(shí)驗(yàn)室的需求，又能靈活適應(yīng)檢測的變化。目前可用的商用系統(tǒng)數(shù)量繁多，其中一些系統(tǒng)主要針對NGS平臺的管理，例如 Exemplar LIMS、Clarity LIMS和 Sequencing LIMS 等。然而，商用系統(tǒng)往往需要較高的安裝成本和大量的配置才能解決實(shí)驗(yàn)室的具體需求。不過，目前也存在一些開放的系統(tǒng)如Galaxy LIMS 。
挑戰(zhàn)四：大范圍的基因組重排（LGRs）和臨床意義不明的變體（VUS）
目前，深度測序法及末端配對測序法已被應(yīng)用于癌癥DNA的LGRs（large genomic rearrangements）檢測。從NGS數(shù)據(jù)中選出LGRs受限于富集方法，PCR富集方法目前不適用于拷貝數(shù)變異（CNVs）的檢測，但雜交富集方法在此方面具有一定的潛力。
然而，這類檢測均需要專業(yè)的生物信息學(xué)分析，且小CNVs的檢測面臨著一些特定的問題，如靈敏度較低等。在NGS能常規(guī)應(yīng)用于臨床上的CNV綜合檢測之前，必須先通過大量的臨床驗(yàn)證。
VUS是數(shù)據(jù)分析時常見的現(xiàn)象，目前國際上不斷發(fā)起數(shù)據(jù)共享聯(lián)盟，旨在推進(jìn)測序方法的發(fā)展以及改進(jìn)基因的變異分類。然而，值得注意的是，由于變異水平的差異，分析人員在使用公共突變數(shù)據(jù)庫時應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。
總結(jié)
隨著基因檢測的需求增加，診斷實(shí)驗(yàn)室需要適應(yīng)當(dāng)前的檢測策略及技術(shù)的發(fā)展。NGS的使用不僅可以滿足不斷上漲的檢測需求，還能降低整體成本等。然而，NGS的選擇復(fù)雜性需綜合考慮多個相互依存的因素。對于檢測結(jié)果的解釋，尤其是解釋臨床意義不明確的變體時，需要進(jìn)行全面且系統(tǒng)的評價，還需要有明確的報(bào)告，此外診斷實(shí)驗(yàn)室還需意識到腫瘤DNA檢測面臨著重大挑戰(zhàn)。
備注：本文根據(jù)European Journal of Human Genetics網(wǎng)站編譯，原文鏈接為New challenges for BRCA testing: a view from the diagnostic laboratory
